一、引言

含有二硫鍵的環(huán)肽代表了一類具有廣泛生物功能的化合物，其功能范圍從毒素到重要的激素。¹二硫鍵有助于穩(wěn)定肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)和構(gòu)象，這有利于提高蛋白水解穩(wěn)定性和目標(biāo)親和力。²由于它們具有潛在的治療價(jià)值，對(duì)合成含二硫鍵橋連的環(huán)肽的興趣穩(wěn)步增長(zhǎng)。通過使用正交保護(hù)的半胱氨酸氨基酸，如Fmoc-(S)-Cys(Mmt)-OH和Fmoc-(S)-Cys(STmp)-OH（圖1），可以制備含有二硫鍵的肽。Cys(Mmt)基團(tuán)可以使用稀釋的三氟乙酉夋(TFA)溶液選擇性去保護(hù)，而Cys(STmp)基團(tuán)則使用二硫蘇糖醇(DTT)作為還原劑進(jìn)行正交去保護(hù)。去保護(hù)后，使用N-氯琥珀酰亞胺(NCS)作為溫和氧化劑，可以選擇性氧化Cys巰基形成二硫鍵。³

在這里，我們報(bào)告了使用Liberty Blue^TM微波肽合成器全自動(dòng)合成良好純度的含二硫鍵橋連的環(huán)肽。一個(gè)骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體激活素樣激酶3 (Alk3)的肽激動(dòng)劑THR-123⁴，在3小時(shí)內(nèi)完成合成，純度為77%。最后，一種含有兩個(gè)二硫鍵的錐蝸牛毒素肽（Conotoxin-SI）⁵在不到4小時(shí)內(nèi)合成，純度為67%。將微波能量應(yīng)用于二硫鍵橋連肽的合成可以實(shí)現(xiàn)更高效的偶聯(lián)，從而快速合成并達(dá)到高純度（CarboMAX^TM）。⁶

圖1. 左：Fmoc-(S)-Cys(Mmt)-OH；右：Fmoc-(S)-Cys(STmp)-OH

二、實(shí)驗(yàn)部分

HE-SPPS材料和方法：所有肽都是在CEM Liberty Blue™自動(dòng)微波肽合成器上合成的，使用的是Rink Amide ProTide™ LL樹脂（0.19 mmol/g替換）或Cl-MPA ProTide™ LL樹脂（0.18 mmol/g替換）。使用DMF進(jìn)行后去保護(hù)洗滌，然后采用DIC/Oxyma活化方法進(jìn)行偶聯(lián)。肽樹脂在CEM Razor^®肽裂解系統(tǒng)上用TFA/TIS/H₂O/DODT（92.5/2.5/2.5/2.5）裂解。肽在冷乙酉迷中沉淀，粗品在分析前進(jìn)行凍干。

分析：粗肽在配備了Acquity UPLC BEH C8柱（1.7 μm, 2.1 x 100 mm）的Waters Acquity UPLC系統(tǒng)上進(jìn)行分析，該系統(tǒng)裝有PDA檢測(cè)器。UPLC系統(tǒng)連接到Waters 2100單四級(jí)桿MS用于結(jié)構(gòu)測(cè)定。峰分析是在Waters MassLynx軟件上完成的。分離是通過（i）水中的0.05% TFA和（ii）乙腈中0.05% TFA的梯度洗脫進(jìn)行的。

三、結(jié)果和討論

A）合成THR-123，CYFDDSSNVLCKKYRS-CO₂H

選擇THR-123（圖2）來展示含有C端酸的單一二硫鍵橋連肽的合成。該肽在10 µmol規(guī)模上使用Cl-MPA ProTide™ LL樹脂（0.18 mmol/g替換）進(jìn)行合成。第一個(gè)氨基酸使用CEM之前報(bào)道的氯化物加載循環(huán)自動(dòng)加載。所有其他氨基酸循環(huán)使用1分鐘/90oC去保護(hù)和一次2分鐘/90oC與DIC/Oxyma偶聯(lián)（使用Fmoc-(S)-Cys(Mmt)-OH用于C）。使用2% TFA的DCM溶液進(jìn)行Cys(Mmt)的去保護(hù)。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行1分鐘，重復(fù)五次。使用25 mM的NCS的DMF溶液實(shí)現(xiàn)二硫鍵的形成。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行15分鐘。在Liberty Blue自動(dòng)微波肽合成器上進(jìn)行的THR-123的微波增強(qiáng)SPPS產(chǎn)生了77%純度的目標(biāo)肽（圖3）。

圖2.THR-123

圖3. THR-123的UPLC色譜圖

B) 合成Conotoxin-SI，ICCNPACGPKYSC-NH₂

選擇Conotoxin-SI（圖4）來展示含有兩個(gè)二硫鍵的環(huán)肽的合成。該肽在10 µmol規(guī)模上使用Rink Amide ProTide™ LL樹脂（0.19 mmol/g替換）進(jìn)行合成。所有氨基酸循環(huán)使用1分鐘/90oC去保護(hù)和一次2分鐘/90oC與DIC/Oxyma偶聯(lián)（使用Fmoc-(S)-Cys(Mmt)-OH用于C；使用Fmoc-(S)-Cys(STmp)-OH用于C）。使用2% TFA的DCM溶液進(jìn)行Cys(Mmt)的去保護(hù)。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行1分鐘，重復(fù)五次。使用25 mM的NCS的DMF溶液實(shí)現(xiàn)二硫鍵的形成。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行15分鐘。使用5% DTT + 0.1 M NMM的DMF溶液進(jìn)行Cys(STmp)的去保護(hù)。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行5分鐘，重復(fù)三次。最后，使用25 mM NCS的DMF溶液形成第二個(gè)二硫鍵（室溫下15分鐘）。在Liberty Blue自動(dòng)微波肽合成器上進(jìn)行的Conotoxin-SI的微波增強(qiáng)SPPS產(chǎn)生了67%純度的目標(biāo)肽（圖5）。

圖4.Conotoxin-S

圖5. Conotoxin-SI的UPLC色譜圖

四、結(jié)論

采用全自動(dòng)快速合成技術(shù)，我們成功高效地完成了含二硫鍵橋接的環(huán)肽的合成，并且實(shí)現(xiàn)了較高的純度。借助CarboMAX™⁶化學(xué)技術(shù)，偶聯(lián)效率得到了顯著提升，這不僅極大縮短了合成時(shí)間，還確保了產(chǎn)物的高純度。例如，一個(gè)C端帶有羧酸的環(huán)狀二硫鍵橋接肽——THR-123，在短短不到3小時(shí)的時(shí)間內(nèi)就被迅速合成出來，且純度達(dá)到了77%。相比之下，傳統(tǒng)的室溫合成方法通常需要長(zhǎng)達(dá)20小時(shí)來合成包含兩個(gè)二硫鍵的Conotoxin-SI。³而利用微波增強(qiáng)的固相肽合成技術(shù)（SPPS），在不到4小時(shí)內(nèi)就制備出了純度為67%的相應(yīng)肽。

引用

1 Góngora-Benítez, M.; Tulla-Puche, J.; Albericio, F. Chem. Rev. 2014, 114 (2), 901–926.

2 Adessi, C.; Soto, C. Curr. Med. Chem. 2002, 9 (9), 963–978.

3 Postma, T. M.; Albericio, F. Org. Lett. 2013, 15 (3), 616–619.

4 Sugimoto, H.; LeBleu, V. S.; Bosukonda, D.; Keck, P.; Taduri, G.; Bechtel, W.; Okada, H.; Carlson, W.; Bey, P.; Rusckowski, M.; Tampe, B.; Tampe, D.; Kanasaki, K.; Zeisberg, M.; Kalluri, R.; Kalluri, R. Nat. Med. 2012, 18 (3), 396–404.

5 Azam, L.; McIntosh, J. M. Acta Pharmacol. Sin. 2009, 30 (6), 771–783.

6 CEM Application Note (AP0124) - “CarboMAX - Enhanced Peptide Coupling at Elevated Temperature."